Главная » Детские игры на знакомство » Применение спектроскопии ямр. Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) – самый безопасный диагностический метод Ямр спектроскопия относится к электрохимическим методам

Применение спектроскопии ямр. Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) – самый безопасный диагностический метод Ямр спектроскопия относится к электрохимическим методам

ЯДЕРНЫЙ МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЯМР), явление резонансного поглощения радиочастотной электромагн. энергии в-вом с ненулевыми магн. моментами ядер, находящимся во внеш. постоянном мага. поле. Ненулевым ядерным магн. моментом обладают ядра 1 Н, 2 Н, 13 С, 14 N, 15 N, 19 F, 29 Si, 31 P и др. ЯМР обычно наблюдается в однородном постоянном магн. поле В 0 , на к-рое накладывается слабое радиочастотное поле В 1 перпендикулярное полю В 0 . Для в-в, у к-рых ядерный спин I= 1 / 2 (1 H, 13 C, 15 N, 19 F, 29 Si, 31 P и др.), в поле В 0 возможны две ориентации магн. дипольного момента ядра "по полю" и "против поля". Возникающие два уровня энергии Е за счет взаимод. магн. момента ядра с полем В 0 разделены интервалом
При условии, что илигде h - постоянная Планка , v 0 - частота радиочастотного поля В 1 , - круговая частота,- т. наз. гиромагн. отношение ядра, наблюдается резонансное поглощение энергии поля B 1 , названное ЯМР. Для нуклидов 1 H, 13 C, 31 Р частоты ЯМР в поле В 0 = 11,7 Тл равны соотв. (в МГц): 500, 160,42 и 202,4; значения (в МГц/Тл): 42,58, 10,68 и 17,24. Согласно квантовой модели в поле В 0 возникает 2I+1 уровней энергии, переходы между к-рыми разрешены при где т - магн. квантовое число.

Техника эксперимента. Параметры спектров ЯМР. На явлении ЯМР основана спектроскопия ЯМР . Спектры ЯМР регистрируют с помощью радиоспектрометров (рис.). Образец исследуемого в-ва помещают как сердечник в катушку генерирующего контура (поле B 1), расположенного в зазоре магнита, создающего поле В 0 так, что При наступает резонансное поглощение, что вызывает падение напряжения на контуре, в схему к-рого включена катушка с образцом. Падение напряжения детектируется, усиливается и подается на развертку осциллографа или записывающее устройство. В совр. радиоспектрометрах ЯМР обычно используют мага, поля напряженностью 1-12 Тл. Область спектра, в к-рой имеется детектируемый сигнал с одним или неск. максимумами, наз. линией поглощения ЯМР. Ширина наблюдаемой линии, измеренная на половине макс. интенсивности и выраженная в Гц, наз. шириной линии ЯМР. Разрешение спектра ЯМР - миним. ширина линии ЯМР, к-рую позволяет наблюдать данный спектрометр. Скорость прохождения - скорость (в Гц/с), с к-рой изменяется напряженность магн. поля или частота воздействующего на образец радиочастотного излучения при получении спектра ЯМР.

Схема спектрометра ЯМР: 1 - катушка с образцом; 2 - полюса магнита; 3 -генератор радиочастотного поля; 4 -усилитель и детектор; 5 - генератор модулирующего напряжения; 6 - катушки модуляции поля В 0 ; 7 - осциллограф.

Поглощенную энергию система перераспределяет внутри себя (т. наз. спин-спиновая, или поперечная релаксация ; характеристич. время Т 2) и отдает в окружающую среду (спин-решеточная релаксация , время релаксации Т 1). Времена Т 1 и Т 2 несут информацию о межъядерных расстояниях и временах корреляции разл. мол. движений. Измерения зависимости Т 1 и Т 2 от т-ры и частоты v 0 дают информацию о характере теплового движения, хим. равновесиях , фазовых переходах и др. В твердых телах с жесткой решеткой Т 2 = 10 мкс, а Т 1 > 10 3 с, т. к. регулярный механизм спин-решеточной релаксации отсутствует и релаксация обусловлена парамагн. примесями. Из-за малости Т 2 естественная ширина линии ЯМР весьма велика (десятки кГц), их регистрация -область ЯМР широких линий. В жидкостях малой вязкости Т 1 T 2 и измеряется секундами. Соотв. линии ЯМР имеют ширину порядка 10 -1 Гц (ЯМР высокого разрешения). Для неискаженного воспроизведения формы линии надо проходить через линию шириной 0,1 Гц в течение 100 с. Это накладывает существенные ограничения на чувствительность спектрометров ЯМР.
Основной параметр спектра ЯМР - хим. сдвиг- взятое с соответствующим знаком отношение разности частот наблюдаемого сигнала ЯМР и нек-рого условно выбранного эталонного сигнала к.-л. стандарта к частоте эталонного сигнала (выражается в миллионных долях, м. д.). Хим. сдвиги ЯМР измеряют в безразмерных величинах отсчитанных от пика эталонного сигнала. Если стандарт дает сигнал на частоте v 0 , то В зависимости от природы исследуемых ядер различают протонный ЯМР, или ПМР, и ЯМР 13 С (таблицы величин хим. сдвигов приведены на форзацах тома),. ЯМР 19 F (см. Фторорганические соединения), ЯМР 31 Р (см. Фосфорорганические соединения)и т. д. Величины обладают существенной характеристичностью и позволяют определять по спектрам ЯМР наличие определенных мол. фрагментов. Соответствующие данные о хим. сдвигах разл. ядер публикуются в справочных и учебных пособиях, а также заносятся в базы данных, к-рыми снабжаются совр. спектрометры ЯМР. В рядах близких по строению соединений хим. сдвиг прямо пропорционален электронной плотности на соответствующих ядрах.
Общепринятый стандарт для ПМР и ЯМР 13 С - тетраметилсилан (ТМС). Стандарт м. б. растворен в исследуемом р-ре (внутр. эталон) или помещен, напр., в запаянный капилляр, находящийся внутри ампулы с образцом (внеш. эталон). В качестве р-рителей могут использоваться лишь такие, чье собственное поглощение не перекрывается с областью, представляющей интерес для исследования. Для ПМР лучшие р-рители - те, что не содержат протонов (СС1 4 , CDC1 3 , CS 2 , D 2 O и др.).
В многоатомных молекулах ядра одинаковых атомов , занимающих химически неэквивалентные положения, имеют различающиеся хим. сдвиги, обусловленные различием магн. экранирования ядер валентными электронами (такие ядра наз. анизохронными). Для i-го ядра где- постоянная диамагн. экранирования, измеряемая в м. д. Для протонов типичный интервал изменений- до 20 м. д., для более тяжелых ядер эти интервалы на 2-3 порядка больше.
Важный параметр спектров ЯМР - константа спин-спинового взаимод. (константа ССВ) - мера непрямого ССВ между разл. магн. ядрами одной молекулы (см. Спин-спиновое взаимодействие); выражается в Гц.
Взаимод. ядерных спинов со спинами электронов , содержащимися в молекуле между ядрами i и j, приводят к взаимной ориентации этих ядер в поле В 0 (ССВ). При достаточном разрешении ССВ приводит к дополнит. мультиплетности линий, отвечающих определенным значениям хим. сдвигов: где J ij - константы ССВ; F ij - величины, значения к-рых определяются спинами ядер i и j, симметрией соответствующего мол. фрагмента, диэдральными углами между хим. связями и числом этих связей между ядрами, участвующими в ССВ.
Если хим. сдвиги достаточно велики, т. е. min max (J ij), то ССВ проявляются в виде простых мультиплетов с биномиальным распределением интенсивностей (спектры первого порядка). Так в этильной группе сигнал метильных протонов проявляется в виде триплета с соотношением интенсивностей 1:2:1, а сигнал метиленовых протонов - в виде квадруплета с соотношением интенсивностей 1:3:3:1. В спектрах ЯМР 13 С метиновые группы - дублеты (1:1), а метиленовые и метильные - соотв. триплеты и квадруплеты, но с большими, чем в протонных спектpax, значениями констант ССВ. Хим. сдвиги в спектрах первого порядка равны интервалам между центрами мультиплетов, а J ij - расстояниям между соседними пиками мультиплета. Если условие первого порядка не выполняется, то спектры становятся сложными: в них ни один интервал, вообще говоря, не равен ни ни J ij . Точные значения параметров спектров получают из квантовомех. расчетов. Соответствующие программы входят в мат. обеспечение совр. спектрометров ЯМР. Информативность хим. сдвигов и констант ССВ превратила спектроскопию ЯМР высокого разрешения в один из важнейших методов качеств. и количеств. анализа сложных смесей, систем, препаратов и композиций, а также исследования строения и реакц. способности молекул . При изучении конформаций , вырожденных и др. динамич. систем, геом. структуры белковых молекул в р-ре, при неразрушающем локальном хим. анализе живых организмов и т. п. возможности методов ЯМР уникальны.

Ядерная намагниченность в-ва. В соответствии с распределением Больцмана в двухуровневой спин-системе из N спинов отношение числа спинов N + на нижнем уровне к числу спинов N - на верхнем уровне равно где k - постоянная Больцмана ; Т - т-ра. При В 0 = 1 Тл и Т=300 К для протонов отношение N + /N - .= 1,00005. Это отношение и определяет величину ядерной намагниченности в-ва, помещенного в поле B 0 . Магн. момент m каждого ядра совершает прецессионное движение относительно оси z, вдоль к-рой направлено поле B 0 ; частота этого движения равна частоте ЯМР. Сумма проекций прецессирующих ядерных моментов на ось z образует макроскопич. намагниченность в-ва M z = 10 18 В плоскости ху, перпендикулярной оси z, проекции векторов из-за случайности фаз прецессии равны нулю: М xy = 0. Поглощение энергии при ЯМР означает, что в единицу времени с нижнего уровня на верхний переходит больше спинов , чем в обратном направлении, т. е. разность населенностей N + - N - убывает (нагрев спин-системы, насыщение ЯМР). При насыщении в стационарном режиме намагниченность системы может сильно возрасти. Это - т. наз. эффект Оверхаузера, для ядер обозначаемый NOE (Nuclear Overhauser effect), к-рый широко применяется для повышения чувствительности, а также для оценки межъядерных расстояний при изучении мол. геометрии методами спектроскопии ЯМР .

Векторная модель ЯМР. При регистрации ЯМР на образец накладывают радиочастотное поле , действующее в плоскости ху. В этой плоскости поле В 1 можно рассматривать как два вектора с амплитудами В 1т/ 2, вращающихся с частотой в противоположных направлениях. Вводят вращающуюся систему координат x"y"z, ось х" к-рой совпадает с вектором В 1т/ 2, вращающимся в том же направлении, что и векторы Его воздействие вызывает изменение угла при вершине конуса прецессии ядерных магн. моментов; ядерная намагниченность М z начинает зависеть от времени, а в плоскости х"у" появляется отличная от нуля проекция ядерной намагниченности. В неподвижной системе координат эта проекция вращается с частотой т. е. в катушке индуктивности наводится радиочастотное напряжение, к-рое после детектирования и дает сигнал ЯМР - ф-цию ядерной намагниченности от частоты различают медленное изменение (свип-режим) и импульсный ЯМР. Реальное сложное движение вектора ядерной намагниченности создает в плоскости х"у" два независимых сигнала: М х, (синфазный с радиочастотным напряжением В 1)и М у" (сдвинутый относительно B 1 по фазе на 90 °С). Одновременная регистрация М х" и M y" (квадратурное детектирование) вдвое повышает чувствительность спектрометра ЯМР. При достаточно большой амплитуде В 1т проекции М z = М х" =М у" =0(насыщение ЯМР). Поэтому при непрерывном действии поля В 1 его амплитуда должна быть весьма малой, чтобы сохранить неизменными исходные условия наблюдения.
В импульсном ЯМР величина В 1 ,наоборот, выбирается настолько большой, чтобы за время t и Т 2 отклонить во вращающейся системе координат вектор M z от оси z на угол . При= 90° импульс называют 90°-ным (/2-импульс); под его воздействием вектор ядерной намагниченности оказывается в плоскости х"у", т. е. После окончания импульса вектор M y" начинает убывать по амплитуде со временем Т 2 благодаря расхождению по фазе составляющих его элементарных векторов (спин-спиновая релаксация). Восстановление равновесной ядерной намагниченности М z происходит со временем спин-решеточной релаксации T 1 . При= 180° (импульс) вектор M z укладывается вдоль отрицат. направления оси z, релаксируя после окончания импульса к своему равновесному положению. Комбинации иимпульсов широко используются в совр. многоимпульсных вариантах спектроскопии ЯМР .
Важной особенностью вращающейся системы координат является различие резонансных частот в ней и в неподвижной системе координат: если B 1 В лок (статич. локальное поле), то вектор М прецессирует во вращающейся системе координат относительно поля При точной настройке в резонанс частота ЯМР во вращающейся системе координат Это позволяет существенно расширить возможности ЯМР при исследовании медленных процессов в в-ве.

Хим. обмен и спектры ЯМР (динамич. ЯМР). Параметрами двухпозиционного обмена А В служат времена пребывания и а также вероятности пребывания иПри низкой т-ре спектр ЯМР состоит из двух узких линий, отстоящих на Гц; затем при уменьшении и линии начинают уширяться, оставаясь на своих местах. Когда частота обмена начинает превышать исходное расстояние между линиями, линии начинают сближаться, а при 10-кратном превышении образуется одна широкая линия в центре интервала (v A , v B), если При дальнейшем росте т-ры эта объединенная линия становится узкой. Сопоставление эксперим. спектра с расчетным позволяет для каждой т-ры указать точную частоту хим. обмена, по этим данным вычисляют термодинамич. характеристики процесса. При многопозиционном обмене в сложном спектре ЯМР теоретич. спектр получают из квантовомех. расчета. Динамич. ЯМР - один из осн. методов изучения стереохим. нежесткости, конформационных равновесий и т. п.

Вращение под магическим углом. Выражение для потенциала диполь-дипольного взаимод. содержит множители где - угол между В 0 и межъядерным вектором r ij . При=arccos 3 -1/2 = 54°44" ("магический" угол) эти множители обращаются в нуль, т. е. исчезают соответствующие вклады в ширину линии. Если закрутить твердый образец с очень большой скоростью вокруг оси, наклоненной под магич. углом к В 0 , то в твердом теле можно получить спектры высокого разрешения с почти столь же узкими линиями, как в жидкости .

Широкие линии в твердых телах . В кристаллах с жесткой решеткой форма линии ЯМР обусловлена статич. распределением локальных магн. полей. Все ядра решетки, за исключением кластера , в трансляционно-инвариантном объеме V 0 вокруг рассматриваемого ядра, дают гауссово распределение g(v) = exp(-v 2 /2a 2), где v - расстояние от центра линии; ширина гауссианы а обратно пропорциональна среднему геом. объемов V 0 и V 1 ,причем V 1 характеризует среднюю по всему кристаллу концентрацию магн. ядер. Внутри V 0 концентрация магн. ядер больше средней, и ближние ядра благодаря диполь-дипольному взаимод. и хим. сдвигам создают спектр, ограниченный на интервале (-b, b), где b примерно вдвое больше а. В первом приближении спектр

Суть явления
Прежде всего, надо заметить, что хотя в названии этого явления присутствует слово «ядерный», к ядерной физике ЯМР никакого отношения не имеет и с радиоактивностью никак не связан. Если говорить о строгом описании, то без законов квантовой механики никак не обойтись. Согласно этим законам, энергия взаимодействия магнитного ядра с внешним магнитным полем может принимать только несколько дискретных значений. Если облучать магнитные ядра переменным магнитным полем, частота которого соответствует разнице между этими дискретными энергетическими уровнями, выраженной в частотных единицах, то магнитные ядра начинают переходить с одного уровня на другой, при этом поглощая энергию переменного поля. В этом и состоит явление магнитного резонанса. Это объяснение формально правильное, но не очень наглядное. Есть другое объяснение, без квантовой механики. Магнитное ядро можно представить как электрически заряженный шарик, вращающийся вокруг своей оси (хотя, строго говоря, это не так). Согласно законам электродинамики, вращение заряда приводит к появлению магнитного поля, т. е. магнитного момента ядра, который направлен вдоль оси вращения. Если этот магнитный момент поместить в постоянное внешнее поле, то вектор этого момента начинает прецессировать, т. е. вращаться вокруг направления внешнего поля. Таким же образом прецессирует (вращается) вокруг вертикали ось юлы, если ее раскрутить не строго вертикально, а под некоторым углом. В этом случае роль магнитного поля играет сила гравитации.

Частота прецессии определяется как свойствами ядра, так и силой магнитного поля: чем сильнее поле, тем выше частота. Затем, если кроме постоянного внешнего магнитного поля на ядро будет воздействовать переменное магнитное поле, то ядро начинает взаимодействовать с этим полем - оно как бы сильнее раскачивает ядро, амплитуда прецессии увеличивается, и ядро поглощает энергию переменного поля. Однако это будет происходить только при условии резонанса, т. е. совпадения частоты прецессии и частоты внешнего переменного поля. Это похоже на классический пример из школьной физики - марширующие по мосту солдаты. Если частота шага совпадает с частотой собственных колебаний моста, то мост раскачивается всё сильнее и сильнее. Экспериментально это явление проявляется в зависимости поглощения переменного поля от его частоты. В момент резонанса поглощение резко возрастает, а простейший спектр магнитного резонанса выглядит вот так:
Фурье-спектроскопия
Первые ЯМР-спектрометры работали именно так, как описано выше - образец помещался в постоянное магнитное поле, и на него непрерывно подавалось радиочастотное излучение. Затем плавно менялась либо частота переменного поля, либо напряженность постоянного магнитного поля. Поглощение энергии переменного поля регистрировалось радиочастотным мостом, сигнал от которого выводился на самописец или осциллограф. Но этот способ регистрации сигнала уже давно не применяется. В современных ЯМР-спектрометрах спектр записывается с помощью импульсов. Магнитные моменты ядер возбуждаются коротким мощным импульсом, после которого регистрируется сигнал, наводимый в РЧ-катушке свободно прецессирующими магнитными моментами. Этот сигнал постепенно спадает к нулю по мере возвращения магнитных моментов в состояние равновесия (этот процесс называется магнитной релаксацией). Спектр ЯМР получается из этого сигнала с помощью Фурье-преобразования. Это стандартная математическая процедура, позволяющая раскладывать любой сигнал на частотные гармоники и таким образом получать частотный спектр этого сигнала. Этот способ записи спектра позволяет значительно понизить уровень шумов и проводить эксперименты намного быстрее.

Один возбуждающий импульс для записи спектра - это самый простейший ЯМР-эксперимент. Однако таких импульсов, разной длительности, амплитуды, с разными задержками между ними и т. п., в эксперименте может быть много, в зависимости от того, какие именно манипуляции исследователю надо провести с системой ядерных магнитных моментов. Тем не менее, практически все эти импульсные последовательности оканчиваются одним и тем же - записью сигнала свободной прецессии с последующим Фурье-преобразованием.
Магнитные взаимодействия в веществе
Сам по себе магнитный резонанс остался бы не более чем занятным физическим явлением, если бы не магнитные взаимодействия ядер друг с другом и с электронной оболочкой молекулы. Эти взаимодействия влияют на параметры резонанса, и с их помощью методом ЯМР можно получать разнообразную информацию о свойствах молекул - их ориентации, пространственной структуре (конформации), межмолекулярных взаимодействиях, химическом обмене, вращательной и трансляционной динамике. Благодаря этому ЯМР превратился в очень мощный инструмент исследования веществ на молекулярном уровне, который широко применяется не только в физике, но главным образом в химии и молекулярной биологии. В качестве примера одного из таких взаимодействий можно привести так называемый химический сдвиг. Суть его в следующем: электронная оболочка молекулы откликается на внешнее магнитное поле и старается его экранировать - частичное экранирование магнитного поля происходит во всех диамагнитных веществах. Это означает, что магнитное поле в молекуле будет отличаться от внешнего магнитного поля на очень небольшую величину, которая и называется химическим сдвигом. Однако свойства электронной оболочки в разных частях молекулы разные, и химический сдвиг тоже разный. Соответственно, условия резонанса для ядер в разных частях молекулы тоже будут отличаться. Это позволяет различать в спектре химически неэквивалентные ядра. Например, если мы возьмем спектр ядер водорода (протонов) чистой воды, то в нем будет только одна линия, поскольку оба протона в молекуле H 2 O совершенно одинаковы. Но для метилового спирта СН 3 ОН в спектре будет уже две линии (если пренебречь другими магнитными взаимодействиями), поскольку тут есть два типа протонов - протоны метильной группы СН 3 и протон, связанный с атомом кислорода. По мере усложнения молекул число линий будет увеличиваться, и если мы возьмем такую большую и сложную молекулу, как белок, то в этом случае спектр будет выглядеть примерно так:
Магнитные ядра
ЯМР можно наблюдать на разных ядрах, но надо сказать, что далеко не все ядра имеют магнитный момент. Часто бывает так, что некоторые изотопы имеют магнитный момент, а другие изотопы того же самого ядра - нет. Всего существует более сотни изотопов различных химических элементов, имеющих магнитные ядра, однако в исследованиях обычно используется не более 1520 магнитных ядер, всё остальное - экзотика. Для каждого ядра есть свое характерное соотношение магнитного поля и частоты прецессии, называемое гиромагнитным отношением. Для всех ядер эти отношения известны. По ним можно подобрать частоту, на которой при данном магнитном поле будет наблюдаться сигнал от нужных исследователю ядер.

Самые важные для ЯМР ядра - это протоны. Их больше всего в природе, и они имеют очень высокую чувствительность. Для химии и биологии очень важны ядра углерода, азота и кислорода, но с ними ученым не очень повезло: наиболее распространенные изотопы углерода и кислорода, 12 С и 16 О, магнитного момента не имеют, у природного изотопа азота 14 N момент есть, но он по ряду причин для экспериментов очень неудобен. Есть изотопы 13 С, 15 N и 17 О, которые подходят для ЯМР-экспериментов, но их природное содержание очень низкое, а чувствительность очень маленькая по сравнению с протонами. Поэтому часто для ЯМР-исследований готовят специальные изотопно-обогащенные образцы, в которых природный изотоп того или иного ядра замещен на тот, который нужен для экспериментов. В большинстве случаев эта процедура весьма непростая и недешевая, но иногда это единственная возможность получить необходимую информацию.
Электронный парамагнитный и квадрупольный резонанс
Говоря про ЯМР, нельзя не упомянуть о двух других родственных физических явлениях - электронном парамагнитном резонансе (ЭПР) и ядерном квадрупольном резонансе (ЯКР). ЭПР по своей сути подобен ЯМР, разница заключается в том, что резонанс наблюдается на магнитных моментах не атомных ядер, а электронной оболочки атома. ЭПР может наблюдаться только в тех молекулах или химических группах, электронная оболочка которых содержит так называемый неспаренный электрон, тогда оболочка имеет ненулевой магнитный момент. Такие вещества называются парамагнетиками. ЭПР, как и ЯМР, также применяется для исследований различных структурно-динамических свойств веществ на молекулярном уровне, но его область использования существенно уже. Это связано в основном с тем, что большинство молекул, особенно в живой природе, не содержит неспаренных электронов. В некоторых случаях можно использовать так называемый парамагнитный зонд, т. е. химическую группу с неспаренным электроном, которая связывается с исследуемой молекулой. Но такой подход имеет очевидные недостатки, которые ограничивают возможности этого метода. Кроме того, в ЭПР нет такого высокого спектрального разрешения (т. е. возможности отличить в спектре одну линию от другой), как в ЯМР.

Объяснить «на пальцах» природу ЯКР труднее всего. Некоторые ядра обладают так называемым электрическим квадрупольным моментом. Этот момент характеризует отклонение распределения электрического заряда ядра от сферической симметрии. Взаимодействие этого момента с градиентом электрического поля, создаваемого кристаллической структурой вещества, приводит к расщеплению энергетических уровней ядра. В этом случае можно наблюдать резонанс на частоте, соответствующей переходам между этими уровнями. В отличие от ЯМР и ЭПР, для ЯКР не нужно внешнего магнитного поля, поскольку расщепление уровней происходит без него. ЯКР также используется для исследования веществ, но область его применения еще уже, чем у ЭПР.
Преимущества и недостатки ЯМР

ЯМР - самый мощный и информативный метод исследования молекул. Строго говоря, это не один метод, это большое число разнообразных типов экспериментов, т. е. импульсных последовательностей. Хотя все они основаны на явлении ЯМР, но каждый из этих экспериментов предназначен для получения какой-то конкретной специфической информации. Число этих экспериментов измеряется многими десятками, если не сотнями. Теоретически ЯМР может если не всё, то почти всё, что могут все остальные экспериментальные методы исследования структуры и динамики молекул, хотя практически это выполнимо, конечно, далеко не всегда. Одно из основных достоинств ЯМР в том, что, с одной стороны, его природные зонды, т. е. магнитные ядра, распределены по всей молекуле, а с другой стороны, он позволяет отличить эти ядра друг от друга и получать пространственно-селективные данные о свойствах молекулы. Почти все остальные методы дают информацию либо усредненную по всей молекуле, либо только о какой-то одной ее части.

Основных недостатков у ЯМР два. Во-первых, это низкая чувствительность по сравнению с большинством других экспериментальных методов (оптическая спектроскопия, флюоресценция, ЭПР и т. п.). Это приводит к тому, что для усреднения шумов сигнал нужно накапливать долгое время. В некоторых случаях ЯМР-эксперимент может проводиться в течение даже нескольких недель. Во-вторых, это его дороговизна. ЯМР-спектрометры - одни из самых дорогих научных приборов, их стоимость измеряется как минимум сотнями тысяч долларов, а самые дорогие спектрометры стоят несколько миллионов. Далеко не все лаборатории, особенно в России, могут позволить себе иметь такое научное оборудование.
Магниты для ЯМР-спектрометров
Одна из самых важных и дорогих частей спектрометра - магнит, создающий постоянное магнитное поле. Чем сильнее поле, тем выше чувствительность и спектральное разрешение, поэтому ученые и инженеры постоянно пытаются получить как можно более высокие поля. Магнитное поле создается электрическим током в соленоиде - чем сильнее ток, тем больше поле. Однако бесконечно увеличивать силу тока нельзя, при очень большом токе провод соленоида просто начнет плавиться. Поэтому уже очень давно для высокопольных ЯМР-спектрометров используются сверхпроводящие магниты, т. е. магниты, в которых провод соленоида находится в сверхпроводящем состоянии. В этом случае электрическое сопротивление провода равно нулю, и выделения энергии не происходит при любой величине тока. Сверхпроводящее состояние можно получить только при очень низких температурах, всего нескольких градусов Кельвина, - это температура жидкого гелия. (Высокотемпературная сверхпроводимость - до сих пор удел только чисто фундаментальных исследований.) Именно с поддержанием такой низкой температуры и связаны все технические сложности конструирования и производства магнитов, которые обуславливают их дороговизну. Сверхпроводящий магнит построен по принципу термоса-матрешки. Соленоид находится в центре, в вакуумной камере. Его окружает оболочка, в которой находится жидкий гелий. Эта оболочка через вакуумную прослойку окружена оболочкой из жидкого азота. Температура жидкого азота - минус 196 градусов по Цельсию, азот нужен для того, чтобы гелий испарялся как можно медленнее. Наконец, азотная оболочка изолируется от комнатной температуры внешней вакуумной прослойкой. Такая система способна сохранять нужную температуру сверхпроводящего магнита очень долго, хотя для этого нужно регулярно подливать в магнит жидкие азот и гелий. Преимущество таких магнитов кроме возможности получать высокие магнитные поля также и в том, что они не потребляют энергии: после запуска магнита ток бегает по сверхпроводящим проводам практически без каких-либо потерь в течение многих лет.
Томография
В обычных ЯМР-спектрометрах магнитное поле стараются сделать как можно более однородным, это нужно для улучшения спектрального разрешения. Но если магнитное поле внутри образца, наоборот, сделать очень неоднородным, это открывает принципиально новые возможности для использования ЯМР. Неоднородность поля создается так называемыми градиентными катушками, которые работают в паре с основным магнитом. В этом случае величина магнитного поля в разных частях образца будет разная, а это значит, что сигнал ЯМР можно наблюдать не от всего образца, как в обычном спектрометре, а только от его узкого слоя, для которого соблюдаются резонансные условия, т. е. нужное соотношение магнитного поля и частоты. Меняя величину магнитного поля (или, что по сути то же самое, частоту наблюдения сигнала), можно менять слой, который будет давать сигнал. Таким образом можно «просканировать» образец по всему объему и «увидеть» его внутреннюю трехмерную структуру, не разрушая образец каким-либо механическим способом. К настоящему времени разработано большое число методик, позволяющих измерять различные параметры ЯМР (спектральные характеристики, времена магнитной релаксации, скорость самодиффузии и некоторые другие) с пространственным разрешением внутри образца. Самое интересное и важное, с практической точки зрения, применение ЯМР-томографии нашлось в медицине. В этом случае исследуемым «образцом» является человеческое тело. ЯМР-томография является одним из самых эффективных и безопасных (но также и дорогих) диагностических средств в различных областях медицины, от онкологии до акушерства. Любопытно заметить, что в названии этого метода медики не употребляют слово «ядерный», потому что некоторые пациенты связывают его с ядерными реакциями и атомной бомбой.
История открытия

Годом открытия ЯМР считается 1945-й, когда американцы Феликс Блох из Стэнфорда и независимо от него Эдвард Парселл и Роберт Паунд из Гарварда впервые наблюдали сигнал ЯМР на протонах. К тому времени уже было много известно о природе ядерного магнетизма, сам эффект ЯМР был теоретически предсказан, и было сделано несколько попыток его экспериментального наблюдения. Важно отметить, что годом раньше в Советском Союзе, в Казани, Евгением Завойским было открыто явление ЭПР. Сейчас уже хорошо известно, что Завойский также наблюдал и сигнал ЯМР, это было перед войной, в 1941 году. Однако в его распоряжении был магнит низкого качества с плохой однородностью поля, результаты были плохо воспроизводимыми и потому так и остались неопубликованными. Справедливости ради надо заметить, что Завойский был не единственным, кто наблюдал ЯМР до его «официального» открытия. В частности, американский физик Исидор Раби (лауреат Нобелевской премии 1944 года за исследование магнитных свойств ядер в атомных и молекулярных пучках) в конце 30-х годов также наблюдал ЯМР, но счел это аппаратурным артефактом. Так или иначе, но за нашей страной остается приоритет в экспериментальном обнаружении магнитного резонанса. Хотя сам Завойский вскоре после войны стал заниматься другими проблемами, его открытие для развития науки в Казани сыграло огромную роль. Казань до сих пор остается одним из ведущих мировых научных центров по ЭПР-спектроскопии.
Нобелевские премии в области магнитного резонанса
В первой половине XX века было присуждено несколько Нобелевских премий ученым, без работ которых открытие ЯМР не могло бы состояться. Среди них можно назвать Петера Зеемана, Отто Штерна, Исидора Раби, Вольфганга Паули. Но непосредственно связанных с ЯМР Нобелевских премий было четыре. В 1952 году премию получили Феликс Блох и Эдвард Парселл за открытие ЯМР. Это единственная «ЯМР-ная» Нобелевская премия по физике. В 1991 году премию по химии получил швейцарец Ричард Эрнст, работавший в знаменитой Швейцарской высшей технической школе в Цюрихе. Он был удостоен ее за развитие методов многомерной ЯМР-спектроскопии, которые позволили кардинально увеличить информативность ЯМР-экспериментов. В 2002 году лауреатом премии, также по химии, стал Курт Вютрих, работавший с Эрнстом в соседних зданиях в той же Технической школе. Он получил премию за разработку методов определения трехмерной структуры белков в растворе. До этого единственным методом, позволяющим определять пространственную конформацию больших биомакромолекул, был только рентгеноструктурный анализ. Наконец, в 2003 году премию по медицине за изобретение ЯМР-томографии получили американец Поль Лаутербур и англичанин Петер Мансфилд. Советский первооткрыватель ЭПР Е. К. Завойский Нобелевской премии, увы, не получил.

ЯМР-спектроскопия

Спектроскопи́я я́дерного магни́тного резона́нса, ЯМР-спектроскопия - спектроскопический метод исследования химических объектов, использующий явление ядерного магнитного резонанса . Наиболее важными для химии и практических применений являются спектроскопия протонного магнитного резонанса (ПМР-спектроскопия), а также спектроскопия ЯМР на ядрах углерода-13 ( 13 C ЯМР-спектроскопия), фтора-19 (инфракрасной спектроскопии, ЯМР выявляет информацию о молекулярном строении химических веществ. Однако, он обеспечивает более полную информацию, чем ИС, позволяя изучать динамические процессы в образце - определять константы скорости химических реакций, величину энергетических барьеров внутримолекулярного вращения. Эти особенности делают ЯМР-спектроскопию удобным средством как в теоретической органической химии, так и для анализа биологических объектов.

Базовая ЯМР техника

Образец вещества для ЯМР помещается в тонкостенную стеклянную трубку (ампулу). Когда ее помещают в магнитное поле, ЯМР активные ядра (такие как 1 H или 13 C) поглощают электромагнитную энергию. Резонансная частота , энергия абсорбции и интенсивность испущенного сигнала пропорциональны силе магнитного поля . Так в поле в 21 Тесла, протон резонирует при частоте 900 МГц.

Химический сдвиг

В зависимости от местного электронного окружения, разные протоны в молекуле резонируют на слегка отличающихся частотах. Так как и это смещение частоты и основная резонансная частота прямо пропорциональны силе магнитного поля, то это смещение преобразуется в независимую от магнитного поля безразмерную величину известную как химический сдвиг. Химический сдвиг определяется как относительное изменение относительно некоторых эталонных образцов. Частотный сдвиг экстремально мал в сравнении с основной ЯМР частотой. Типичный сдвиг частоты равен 100 Гц, тогда как базовая ЯМР частота имеет порядок 100 МГц. Таким образом химический сдвиг часто выражается в частях на миллион (ppm). Для того что обнаружить такое маленькое различие частоты, приложенное магнитное поле должно быть постоянным внутри объема образца.

Так как химический сдвиг зависит от химического строения вещества, он применяется для получения структурной информации о молекулах в образце. К примеру, спектр для этанола (CH 3 CH 2 OH) дает 3 отличительных сигнала, то есть 3 химических сдвига: один для группы CH 3 , второй для СН 2 -группы и последний для OH. Типичный сдвиг для CH 3 -группы примерно равен 1 ppm, для CH 2 -группы присоединенной к OH-4 ppm и OH примерно 2-3 ppm.

Из-за молекулярного движения при комнатной температуре сигналы 3 метиловых протонов усредняются в течение ЯМР процесса, который длится лишь несколько миллисекунд. Эти протоны вырождаются и формируют пики при том же химическом сдвиге. Программное обеспечение позволяет проанализировать размер пиков для того, чтобы понять как много протонов дает вклад в эти пики.

Спин-спиновое взаимодействие

Наиболее полезную информацию для определения структуры в одномерном ЯМР-спектре даёт так называемое спин-спиновое взаимодействие между активными ЯМР ядрами. Это взаимодействие возникает в результате переходов между различными спиновыми состояниями ядер в химических молекулах , что приводит к расщеплению сигналов ЯМР. Это расщепление может быть простым и сложным и, как следствие, его либо просто интерпретировать, либо оно может запутать экспериментатора.

Это связывание обеспечивает детальную информацию о связях атомов в молекуле.

Взаимодействие второго порядка (сильное)

Простое спин-спиновое взаимодействие предполагает, что константа взаимодействия мала в сравнении с разницей в химических сдвигах между сигналами. Если разность сдвигов уменьшается (или константа взаимодействия увеличивается), интенсивность мультиплетов образцов искажается, становится более сложной для анализа (особенно если система содержит более 2 спинов). Однако в мощных ЯМР-спектрометрах искажения обычно умеренные и это позволяет легко интерпретировать связанные пики.

Эффекты второго порядка уменьшаются с увеличением разницы частоты между мультиплетами, поэтому высокочастотный ЯМР спектр показывает меньшее искажение чем низкочастотный спектр.

Приложение ЯМР спектроскопии к исследованию белков

Большинство последних инноваций в ЯМР спектроскопии сделаны в так называемой ЯМР спектроскопии белков, которая становится очень важной техникой в современной биологии и медицине. Общей задачей является получение 3-мерной структуры белка в высоком разрешении, подобно изображениям получаемым в рентгеновской кристаллографии. Из-за присутствия большего числа атомов в белковой молекулы в сравнении с простым органическим соединением, базовый 1 D спектр переполнен перекрывающимися сигналами, поэтому прямой анализ спектра становится невозможным. Поэтому были разработаны многомерные техники, чтобы решить эту проблему.

Чтобы улучшить результаты этих экспериментов применяют метод меченых атомов, используя 13 С или 15 N. Таким образом становится возможным получить 3D-спектр белкового образца, что стало прорывом в современой фармацевтике. В последнее время получают распространение методики(имеющие как преимущества так и недостатки) получения 4D-спектров и спектров большей размерности, основанные на методах нелинейного семплирования с последующим восстановлением сигнала спада свободной индукции с помощью специальных математических методик.

Литература

Гюнтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР. - Пер. с англ. - М ., 1984.

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "ЯМР-спектроскопия" в других словарях:

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса на ядрах углерода 13, 13C ЯМР спектроскопия один из методов ЯМР спектроскопии, использующий ядра изотопа углерода 13C. Ядро 13C имеет в основном состоянии спин 1/2, его содержание в природе… … Википедия

Изображение мозга человека на медицинском ЯМР томографе Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, содержащим ядра с ненулевым спином во внешнем магнитном поле, обусловленное переориентацией… … Википедия

спектроскопия ЯМР

спектроскопия магнитного резонанса - magnetinio branduolių rezonanso spektroskopija statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Spektroskopija, pagrįsta kietųjų, skystųjų ir dujinių medžiagų magnetinio branduolių rezonanso reiškiniu. atitikmenys: angl. NMR… … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas

спектроскопия ядерного магнитного резонанса - branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija statusas T sritis fizika atitikmenys: angl. NMR spectroscopy; nuclear magnetic resonance spectroscopy vok. magnetische Kernresonanzspektroskopie, f; NMR Spektroskopie, f rus. спектроскопия ядерного … Fizikos terminų žodynas

Magnetinio branduolių rezonanso spektroskopija statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Spektroskopija, pagrįsta kietųjų, skystųjų ir dujinių medžiagų magnetinio branduolių rezonanso reiškiniu. atitikmenys: angl. NMR… … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas

ядерно-резонансная спектроскопия - branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija statusas T sritis fizika atitikmenys: angl. NMR spectroscopy; nuclear magnetic resonance spectroscopy vok. magnetische Kernresonanzspektroskopie, f; NMR Spektroskopie, f rus. спектроскопия ядерного … Fizikos terminų žodynas

Совокупность методов иссл. в ва по спектрам поглощения их атомами, ионами и молекулами эл. магн. волн радиодиапазона. К Р. относятся методы электронного парамагн. резонанса (ЭПР), ядерного магн. резонанса (ЯМР), циклотронного резонанса и др … Естествознание. Энциклопедический словарь

Спектроскопия ЯМР относится к неразрушающим методам анализа. Совр. импульсная ЯМР фурье-спектроскопия позволяет вести анализ по 80 магн. ядрам. ЯМР спектроскопия - один из осн. физ.-хим. методов анализа, ее данные используют для однозначной идентификации как промежут. продуктов хим. р-ций, так и целевых в-в. Помимо структурных отнесений и количеств. анализа, спектроскопия ЯМР приносит информацию о конформационных равновесиях, диффузии атомов и молекул в твердых телах, внутр. движениях, водородных связях и ассоциации в жидкостях, кето-енольной таутомерии, металлo- и прототропии, упорядоченности и распределении звеньев в полимерных цепях, адсорбции в-в, электронной структуре ионных кристаллов, жидких кристаллов и др. Спектроскопия ЯМР - источник информации о структуре биополимеров, в т. ч. белковых молекул в р-рах, сопоставимой по достоверности с данными рентгеноструктурного анализа. В 80-е гг. началось бурное внедрение методов спектроскопии и томографии ЯМР в медицину для диагностики сложных заболеваний и при диспансеризации населения.
Число и положение линий в спектрах ЯМР однозначно характеризуют все фракции сырой нефти, синтетич. каучуков, пластмасс, сланцев, углей, лекарств, препаратов, продукции хим. и фармацевтич. пром-сти и др.
Интенсивность и ширина линии ЯМР воды или масла позволяют с высокой точностью измерять влажность и масличность семян, сохранность зерна. При отстройке от сигналов воды можно регистрировать содержание клейковины в каждом зерне, что так же, как и анализ масличности, позволяет вести ускоренную селекцию с.-х. культур.
Применение все более сильных магн. полей (до 14 Тл в серийных приборах и до 19 Тл в эксперим. установках) обеспечивает возможность полного определения структуры белковых молекул в р-рах, экспресс-анализа биол. жидкостей (концентрации эндогенных метаболитов в крови, моче, лимфе, спинномозговой жидкости), контроля качества новых полимерных материалов. При этом применяют многочисленные варианты многоквантовых и многомерных фурье-спектроскопич. методик.
Явление ЯМР открыли Ф. Блох и Э. Пёрселл (1946), за что были удостоены Нобелевской премии (1952).

Явление ядерного магнитного резонанса можно применять не только в физике и химии, но и в медицине: организм человека - это совокупность все тех же органических и неорганических молекул.
Чтобы наблюдать это явление, объект помещают в постоянное магнитное поле и подвергают действию радиочастотных и градиентных магнитных полей. В катушке индуктивности, окружающей исследуемый объект, возникает переменная электродвижущая сила (ЭДС), амплитудно-частотный спектр которой и переходные во времени характеристики несут информацию о пространственной плотности резонирующих атомных ядер, а также о других параметрах, специфических только для ядерного магнитного резонанса. Компьютерная обработка этой информации формирует объёмное изображение, которое характеризует плотность химически эквивалентных ядер, времена релаксации ядерного магнитного резонанса, распределение скоростей потока жидкости, диффузию молекул и биохимические процессы обмена веществ в живых тканях.
Сущность ЯМР-интроскопии (или магнитно-резонансной томографии) состоит, по сути дела, в реализации особого рода количественного анализа по амплитуде сигнала ядерного магнитного резонанса. В обычной ЯМР-спектроскопии стремятся реализовать, по возможности, наилучшее разрешение спектральных линий. Для этого магнитные системы регулируются таким образом, чтобы в пределах образца создать как можно лучшую однородность поля. В методах ЯМР-интроскопии, напротив, магнитное поле создается заведомо неоднородным. Тогда есть основание ожидать, что частота ядерного магнитного резонанса в каждой точке образца имеет свое собственное значение, отличающееся от значений в других частях. Задав какой-либо код для градаций амплитуды ЯМР-сигналов (яркость или цвет на экране монитора), можно получить условное изображение (томограмму) срезов внутренней структуры объекта.
ЯМР-интроскопия, ЯМР-томография впервые в мире изобретены в 1960 г. В. А. Ивановым. Заявку на изобретение (способ и устройство) некомпетентный эксперт отклонил «… ввиду явной бесполезности предлагаемого решения», поэтому авторское свидетельство на это было выдано лишь более чем через 10 лет. Таким образом, официально признано, что автором ЯМР-томографии является не коллектив нижеуказанных нобелевских лауреатов, а российский учёный. Невзирая на этот юридический факт, Нобелевская премия была присуждена за ЯМР-томографию вовсе не В. А. Иванову.Спектральные аппараты

Для точного исследования спектров такие простые приспособления, как узкая щель, ограничивающая световой пучок, и призма, уже недостаточны. Необходимы приборы, дающие четкий спектр, т. е. приборы, хорошо разделяющие волны различной длины и не допускающие перекрытия отдельных участков спектра. Такие приборы называют спектральными аппаратами. Чаще всего основной частью спектрального аппарата является призма или дифракционная решетка.

ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС

Cуть метода

Суть явления электронного парамагнитного резонанса заключается в резонансном поглощении электромагнитного излучения неспаренными электронами. Электрон имеет спин и ассоциированный с ним магнитный момент.

Если поместить свободный радикал с результирующим моментом количества движения J в магнитном поле с напряжённостью B 0 , то для J, отличного от нуля, в магнитном поле снимается вырождение, и в результате взаимодействия с магнитным полем возникает 2J+1 уровней, положение которых описывается выражением: W =gβB 0 M, (где М = +J, +J-1, …-J) и определяется Зеемановским взаимодействием магнитного поля с магнитным моментом J. Расщепление энергетических уровней электрона показано на рисунке.

Энергетические уровни и разрешенные переходы для атома с ядерным спином 1 в постоянном (А) и переменном (В) поле.

Если теперь к парамагнитному центру приложить электромагнитное поле с частотой ν, поляризованное в плоскости, перпендикулярной вектору магнитного поля B 0 , то оно будет вызывать магнитные дипольные переходы, подчиняющиеся правилу отбора ΔМ = 1. При совпадении энергии электронного перехода с энергией фотонаэлектромагнитной волны будет происходить резонансное поглощение СВЧизлучения. Таким образом, условие резонанса определяются фундаментальным соотношением магнитного резонанса

Поглощение энергии СВЧ поля наблюдается в том случае, если между уровнями существует разность заселённостей.

При тепловом равновесии существует небольшая разность заселённостей зеемановских уровней, определяемая больцмановским распределением = exp(gβB 0 /kT). В такой системе при возбуждении переходов очень быстро должно наступить равенство заселённостей энергетических подуровней и исчезнуть поглощение СВЧ поля. Однако, в действительности существует много различных механизмов взаимодействия, в результате которых электрон безызлучательно переходит в первоначальное состояние. Эффект неизменности интенсивности поглощения при увеличении мощности возникает за счёт электронов, не успевающих релаксировать, и называется насыщением. Насыщение появляется при высокой мощности СВЧ излучения и может заметно исказить результаты измерения концентрации центров методом ЭПР.

Значение метода

Метод ЭПР даёт уникальную информацию о парамагнитных центрах. Он однозначно различает примесные ионы, изоморфно входящие в решётку от микровключений. При этом получается полная информация о данном ионе в кристалле: валентность, координация, локальная симметрия, гибридизация электронов, сколько и в какие структурные положения электронов входит, ориентирование осей кристаллического поля в месте расположения этого иона, полная характеристика кристаллического поля и детальные сведения о химической связи. И, что очень важно, метод позволяет определить концентрацию парамагнитных центров в областях кристалла с разной структурой.

Но спектр ЭПР это не только характеристика иона в кристалле, но и самого кристалла, особенностей распределения электронной плотности, кристаллического поля, ионности-ковалентности в кристалле и наконец просто диагностическая характеристика минерала, так как каждый ион в каждом минерале имеет свои уникальные параметры. В этом случае парамагнитный центр является своеобразным зондом, дающим спектроскопические и структурные характеристики своего микроокружения.

Это свойство используется в т. н. методе спиновых меток и зондов, основанном на введении стабильного парамагнитного центра в исследуемую систему. В качестве такого парамагнитного центра, как правило, используют нитроксильный радикал, характеризующийся анизотропными g и A тензорами.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Спектроскопия ядерного ОФС.1.2.1.1.0007.15
магнитного резонанса Взамен ГФ XII , ч.1,
ОФС 42-0046-07

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) – метод, основанный на поглощении радиочастотного электромагнитного излучения ядрами образца с ненулевым магнитным моментом, помещенного в постоянное магнитное поле (B 0). Ненулевые магнитные моменты имеют изотопы ядер элементов с нечетной атомной массой (1 H, 13 C, 15 N, 19 F, 31 P и др.).

Общие принципы

Вращающееся вокруг своей оси ядро имеет собственный момент количества движения (угловой момент, или спин) P . Магнитный момент ядра μ прямо пропорционален спину: μ = γ ∙ P (γ – коэффициент пропорциональности или гиромагнитное отношение). Угловой и магнитный моменты являются квантованными, т.е. могут находиться в одном из 2I + 1 спиновых состояний (I – спиновое квантовое число ). Различные состояния магнитных моментов ядер обладают одинаковой энергией, если на них не действует внешнее магнитное поле. При помещении ядер во внешнее магнитное поле B 0 энергетическое вырождение ядер снимается и возникает возможность энергетического перехода с одного уровня на другой. Процесс распределения ядер между различными энергетическими уровнями протекает в соответствии с законом распределения Больцмана и приводит к появлению макроскопической равновесной продольной намагниченности М z . Время, которое требуется для создания М z после включения внешнего магнитного поля В 0 , называется временем продольной или спин —решеточной релаксации (Т 1). Нарушение равновесного распределения ядер происходит под действием радиочастотного магнитного поля (B 1), перпендикулярного B 0 , которое вызывает дополнительные переходы между энергетическими уровнями, сопровождающиеся поглощением энергии (явление ядерного магнитного резонанса) . Частота ν 0 , при которой возникает поглощение энергии ядрами (Ларморова или резонансная частота поглощения ), изменяется в зависимости от величины постоянного поля B 0: ν 0 = γB 0 /2π. В момент резонанса происходит взаимодействие между индивидуальными ядерными магнитными моментами и полем В 1 , которое выводит вектор М z из его равновесного положения вдоль оси z . В результате появляется поперечная намагниченность М xy . Ее изменение, связанное с обменом внутри спиновой системы, характеризуется временем поперечной или спин-спиновой релаксации (Т 2).

Зависимость интенсивности поглощения энергии ядрами одного типа от частоты радиочастотного магнитного поля при фиксированном значении В 0 называется одномерным спектром ядерного магнитного резонанса ядра данного типа. Спектр ЯМР может быть получен двумя способами: при непрерывном облучении образца радиочастотным полем с изменяющейся частотой, в результате чего регистрируется непосредственно спектр ЯМР (спектроскопия с непрерывным облучением), или при воздействии на образец короткого радиочастотного импульса (импульсная спектроскопия ). В импульсной спектроскопии ЯМР регистрируется затухающее во времени когерентное излучение, испускаемое ядрами при возвращении в исходное спиновое состояние (сигнал спада свободной индукции ) с последующим преобразованием временной шкалы в частотную (Фурье-преобразование ).

В молекулах электроны атомов уменьшают величину действующего внешнего магнитного поля B 0 в месте нахождения ядра, т.е. проявляется диамагнитное экранирование :

B лок = B 0 ∙ (1 – σ),

B лок – напряженность результирующего поля;

σ – константа экранирования.

Разница в резонансных частотах сигналов ядер, равная разнице в их константах экранирования, называется химическим сдвигом сигналов, обозначается символом δ , измеряется в миллионных долях (м.д.). Взаимодействие магнитных моментов ядер через посредство электронов химической связи (спин-спиновое взаимодействие ) вызывает расщепление сигнала ЯМР (мультиплетность, m ). Количество компонент в мультиплетах определяется спином ядра и количеством взаимодействующих ядер. Мерой спин-спинового взаимодействия является константа спин-спинового взаимодействия (J , измеряется в герцах, Гц). Значения δ, m и J не зависят от величины постоянного магнитного поля.

Интенсивность сигнала ЯМР ядра в спектре определяется заселенностью его энергетических уровней. Из ядер с естественным содержанием изотопов наиболее интенсивные сигналы дают ядра водорода. На интенсивность сигналов ЯМР также влияет время продольно-поперечной релаксации (большие Т 1 ведут к уменьшению интенсивности сигнала).

Ширина сигналов ЯМР (разница между частотами на полувысоте сигнала) зависит от Т 1 и Т 2 . Малые времена T 1 и Т 2 обуславливают широкие и мало интерпретируемые сигналы спектра.

Чувствительность метода ЯМР (предельно обнаруживаемая концентрация вещества) зависит от интенсивности сигнала ядра. Для ядер 1 Н чувствительность составляет 10 -9 ÷ 10 -11 моль.

Корреляции различных спектральных параметров (например, химических сдвигов различных ядер в пределах одной молекулярной системы) могут быть получены гомо- и гетероядерными методами в формате 2D или 3D.

Прибор

Импульсный спектрометр ЯМР (ЯМР-спектрометр) с высокой разрешающей способностью состоит из:

магнита для создания постоянного магнитного поля B 0 ;
термостатируемого датчика с держателем образца для подачи радиочастотного импульса и определения излучения, испускаемого образцом;
электронного устройства для создания радиочастотного импульса, регистрации, усиления и преобразования сигнала спада свободной индукции в цифровую форму;
устройства для настройки и регулировки электронных контуров;
устройства сбора и обработки данных (компьютер);

и может также включать:

проточную кювету для проведения жидкостной хроматографии ядерного магнитного резонанса или проточно-инъекционного анализа;

систему для создания импульсного градиента магнитного поля.

Сильное магнитное поле генерируется катушкой сверхпроводимости в сосуде Дьюара, заполненном жидким гелием.

Следует проверять надлежащее функционирование ЯМР-спектрометра. Для проверки проводят соответствующие испытания, включающие, как правило, измерение ширины спектральной линии на полувысоте определенных пиков при определенных условиях (разрешение ), воспроизводимость положения сигнала и отношение сигнал/шум (отношение между интенсивностью определенного сигнала в спектре ЯМР и случайных колебаний в области спектра, не содержащего сигналов от анализируемого вещества, S /N ) для стандартных смесей. В программном обеспечении спектрометров имеются алгоритмы по определению S/N . Все изготовители приборов предоставляют спецификации и протоколы измерения этих параметров.

Спектроскопия ЯМР образцов в растворах

Методика

Испытуемый образец растворяют в растворителе, к которому может быть добавлен соответствующий эталон для калибровки химического сдвига, как указано в нормативной документации. Величина относительного химического сдвига ядра вещества (δ в-во) определяется следующим выражением:

δ в-во = (ν в-во – ν эталон)/ν прибора,

ν в-во – частота резонанса ядра вещества, Гц;

ν эталон – частота резонанса ядра эталона, Гц;

ν прибора – рабочая частота ЯМР-спектрометра (частота, на которой выполняются условия резонанса для ядер водорода при данном B 0 , МГц).

Для растворов в органических растворителях химический сдвиг в спектрах 1 H и 13 C измеряется относительно сигнала тетраметилсилана, положение которого принято за 0 м.д. Отсчет химических сдвигов ведется в сторону слабого поля (влево) от сигнала тетраметилсилана (дельта – шкала химических сдвигов). Для водных растворов в качестве эталона в спектрах ЯМР 1 H используется 2,2-диметил-2-силанпентан-5-сульфонат натрия, химический сдвиг протонов метильной группы которого равен 0,015 м.д. Для спектров 13 C водных растворов в качестве эталона используют диоксан, химический сдвиг которого равен 67,4 м.д.

При калибровке спектров 19 F в качестве первичного эталона с нулевым значением химического сдвига используют трифторуксусную кислоту или трихлорфторметан; спектров 31 P – 85 % раствор ортофосфорной кислоты или триметилфосфат; спектров 15 N – нитрометан либо насыщенный раствор аммиака. В 1 Н и 13 С ЯМР, как правило, используют внутренний эталон, который непосредственно прибавляют к испытуемому образцу. В 15 N, 19 F и 31 Р ЯМР часто используют внешний эталон, который находится отдельно в коаксиальной цилиндрической пробирке или капилляре.

При описании спектров ЯМР необходимо указывать растворитель, в котором растворено вещество, и его концентрацию. В качестве растворителей используют легкоподвижные жидкости, в которых для уменьшения интенсивности сигналов растворителей атомы водорода заменены атомами дейтерия. Дейтерированный растворитель выбирают, исходя из следующих критериев:

1) растворимости в нем испытуемого соединения;
2) отсутствия перекрывания сигналов остаточных протонов дейтерированного растворителя с сигналами испытуемого соединения;
3) отсутствия взаимодействия между растворителем и испытуемым соединением, если не указано иначе.

Атомы растворителя дают сигналы, которые легко идентифицируются по их химическому сдвигу и могут использоваться для калибровки оси химического сдвига (вторичный эталон). Химические сдвиги сигналов остаточных протонов дейтерированных растворителей имеют следующие значения (м.д.): хлороформ — 7,26; бензол — 7,16; вода — 4,7; метанол -3,35 и 4,78; диметилсульфоксид — 2,50; ацетон — 2,05; положение сигнала воды и протонов гидроксильных групп спиртов зависит от pH среды и температуры.

Для количественного анализа растворы не должны содержать нерастворенных частиц. При некоторых количественных определениях может потребоваться добавление внутреннего стандарта для сравнения интенсивности испытуемого и стандартного образцов. Соответствующие стандартные образцы и их концентрации должны быть указаны в нормативной документации. После помещения образца в пробирку и укупорки образец вводят в магнит ЯМР-спектрометра, устанавливают параметры испытания (параметры настройки, регистрации, оцифровки сигнала спада свободной индукции). Основные параметры испытания, приводимые в нормативной документации, записывают или сохраняют в компьютере.

Для предотвращения дрейфа спектра во времени выполняют стабилизационную процедуру (дейтериевый лок), используя сигнал дейтерия, вызываемый дейтерированными растворителями, если не указано иначе. Прибор регулируют для получения наиболее оптимальных условий резонанса и максимального соотношения S/N (шиммирование ).

В ходе испытания возможно выполнение многократных последовательностей циклов «импульс – сбор данных – пауза» с последующим суммированием отдельных сигналов спада свободной индукции и усреднением уровня шума. Время задержки между импульсными последовательностями, в течение которого система ядерных спинов восстанавливает свою намагниченность (D 1), для количественных измерений должно превышать время продольной релаксации T 1: D 1 ≥ 5 T 1 . В программном обеспечении спектрометров имеются алгоритмы по определению T 1 . Если величина T 1 неизвестна, рекомендуется использовать значение D 1 = 25 c.

После проведения Фурье-преобразования сигналы в частотном представлении калибруют под выбранный эталон и измеряют их относительную интенсивность путем интегрирования – измерения отношения площадей резонансных сигналов. В спектрах 13 С интегрируют только однотипные сигналы. Точность интегрирования сигнала зависит от соотношения сигнал – шум (S/N) :

где u (I ) – стандартная неопределенность интегрирования.

Число накоплений спада свободной индукции, необходимое для достижения удовлетворительного соотношения S / N , должно быть приведено в нормативной документации.

Наряду с одномерными в аналитических целях используют гомо- и гетероядерные двумерные корреляционные спектры, основанные на определенной последовательности импульсов (COSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC, HETCOR, CIGAR, INADEQUATE и др.). В двумерных спектрах взаимодействие между ядрами проявляется в виде сигналов, называемых кросс-пиками. Положение кросс-пиков определяется значениями химических сдвигов двух взаимодействующих ядер. Двумерные спектры предпочтительно использовать для определения состава сложных смесей и экстрактов, т.к. вероятность наложения сигналов (кросс-пиков) в двумерных спектрах существенно ниже, чем вероятность наложения сигналов в одномерных спектрах.

Для быстрого получения спектров гетероядер (13 C, 15 N и др.) применяют методики (HSQC, HMBC), которые позволяют получать на ядрах 1 H спектры других ядер, используя механизмы гетероядерного взаимодействия.

Методика DOSY, основанная на регистрации потери фазовой когерентности ядерных спинов за счет трансляционных перемещений молекул под действием градиента магнитного поля, позволяет получать спектры индивидуальных соединений (спектральное разделение) в смеси без их физического разделения и определять размеры, степени агрегированности и молекулярные массы молекулярных объектов (молекул, макромолекул, молекулярных комплексов, супрамолекулярных систем).

Области применения

Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ядерного магнитного резонанса, позволяет использовать метод ядерного магнитного резонанса для проведения качественного и количественного анализа. Применение спектроскопии ядерного магнитного резонанса в количественном анализе основано на прямой пропорциональности молярной концентрации магнитно-активных ядер интегральной интенсивности соответствующего сигнала поглощения в спектре.

Установление подлинности действующего вещества . Установление подлинности действующего вещества осуществляют путем сравнения спектра испытуемого образца со спектром стандартного образца или с опубликованным эталонным спектром. Спектры стандартных и испытуемых образцов должны быть получены с использованием одних и тех же методик и условий. Пики в сравниваемых спектрах должны совпадать по положению (отклонения значений δ испытуемого и стандартных образцов в пределах ± 0,1 м.д. для ядерного магнитного резонанса 1 Н и ± 0,5 м.д. для ядерного магнитного резонанса 13 С), интегральной интенсивности и мультиплетности, значения которых следует приводить при описании спектров. При отсутствии стандартного образца можно использовать фармакопейный стандартный образец, идентичность которого подтверждают самостоятельной структурной интерпретацией спектральных данных и альтернативными методами.

При подтверждении подлинности образцов нестехиометрического состава (например, природных полимеров переменного состава) допускают несовпадение пиков испытуемого и стандартных образцов по положению и интегральной интенсивности сигналов. Сравниваемые спектры должны быть подобны, т.е. содержать одинаковые характеристические области сигналов, подтверждающие совпадение фрагментного состава испытуемого и стандартных образцов.

Для установления подлинности смеси веществ (экстрактов) допускают использование одномерных спектров ЯМР целиком, как «отпечатков пальца» объекта, без детализации значений δ и мультиплетности отдельных сигналов. В случае использования двумерной спектроскопии ЯМР при описании спектров (фрагментов спектра), заявленных на подлинность, следует приводить значения кросс-пиков.

Идентификация посторонних примесей/остаточных органических растворителей . Идентификацию посторонних примесей/остаточных органических растворителей осуществляют аналогично установлению подлинности действующего вещества, ужесточая требования к чувствительности и цифровому разрешению.
Определение содержания посторонних примесей/остаточных органических растворителей относительно действующего вещества . Метод ЯМР является прямым абсолютным методом определения мольного соотношения действующего вещества и примесного соединения (n /n примесь):

где S ‘ и S ‘ примесь – нормированные значения интегральных интенсивностей сигналов действующего вещества и примеси.

Нормирование проводят по числу ядер в структурном фрагменте, обуславливающих измеряемый сигнал.

Массовую долю примеси/остаточного органического растворителя относительно действующего вещества (X пр) определяют по формуле:

M пр – молекулярная масса примеси;

M – молекулярная масса действующего вещества;

S ‘ пр – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала примеси;

S’ – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала действующего вещества.

Количественное определение содержания вещества (действующего вещества, примеси/остаточного растворителя) в фармацевтической субстанции . Абсолютное содержание вещества в фармацевтической субстанции определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов определяемого вещества, не перекрываясь с ними. Интенсивности сигналов определяемого вещества и стандарта не должны существенно различаться.

Процентное содержание определяемого вещества в испытуемом образце в пересчете на сухое вещество (X, % масс) вычисляют по формуле:

X, % масс = 100 ∙ (S ‘ /S ‘ 0) ∙ (M ∙ a 0 /M 0 ∙ a ) ∙ ,

S’ – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала определяемого вещества;

S ‘ 0 – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала стандарта;

M – молекулярная масса определяемого вещества;

M 0 – молекулярная масса;

a – навеска испытуемого образца;

a 0 – навеска вещества-стандарта;

W – содержание влаги, %.

В качестве веществ-стандартов можно использовать следующие соединения: малеиновая кислота (2H; 6,60 м.д., M = 116,07), бензилбензоат (2H; 5,30 м.д., M = 212,25), малоновая кислота (2H; 3,30 м.д., M = 104,03), сукцинимид (4H; 2,77 м.д., M = 99,09), ацетанилид (3H; 2,12 м.д., M = 135,16), трет -бутанол (9H; 1,30 м.д., M = 74,12).

Относительное содержание вещества как доля компонента в смеси компонентов фармацевтической субстанции определяется методом внутренней нормализации. Мольная (X моль) и массовая (X масс) доля компонента i в смеси n веществ определяется по формулам:

Определение молекулярной массы белков и полимеров . Молекулярные массы белков и полимеров определяют сравнением их подвижности с подвижностью соединений-стандартов с известной молекулярной массой, используя методики DOSY. Измеряют коэффициенты самодиффузии (D ) испытуемых и стандартных образцов, строят график зависимости логарифмов молекулярных масс соединений-стандартов от логарифмов D . По полученному таким образом графику методом линейной регрессии определяют неизвестные молекулярные массы испытуемых образцов. Полное описание DOSY-эксперимента должно быть приведено в нормативной документации.

Спектроскопия ЯМР твердых веществ

Образцы в твердом состоянии анализируют с помощью специально оборудованных ЯМР-спектрометров. Определенные технические операции (вращение порошкообразного образца в роторе, наклоненном под магическим углом (54,7°) к оси магнитного поля В 0 , силовое распаривание, перенос поляризации от легковозбудимых ядер к менее поляризуемым ядрам – кросс-поляризация) позволяют получать спектры органических и неорганических соединений с высокой разрешающей способностью. Полное описание процедуры должно быть приведено в нормативной документации. Основная область применения данной разновидности спектроскопии ЯМР – изучение полиморфизма твёрдых лекарственных средств.

Просмотров